(1)运用 CRISPR/Cas9 系统进行大鼠或小鼠条件基因敲除模型构建:
设计两条 sgRNA 及带有 LoxP 位点的同源重组模板,利用 CRISPR/Cas9介导的同源重组,在靶基因特定外显子两侧的内含子中各敲入一段方向相同的 LoxP 序列,在 Cre 重组酶的作用下,两个 LoxP 位点间的靶基因被切除,起到条件敲除靶基因的作用。
(2)条件敲除同时兼具报告基因功能的大鼠或小鼠构建:
利用 CRISPR/Cas9 介导的同源重组在内含子中定点敲入反向的带有剪切接受子 Sa、绿色荧光蛋白 GFP 和转录终止信号 polyA 的片段,并在片段两侧插入两对交错排列的 lox66 和 lox71 序列。在 Cre 重组酶的作用下,插入片段被倒转为正向序列,使反向插入的 DNA 片段形成一个新的外显子, 融合表达 GFP 报告基因同时终止内源基因的转录, 起到敲除靶基因同时标记被敲除细胞的效果。