前言

2019年3月25日，国际著名学术期刊《Nature Medicine》在线发表了邦耀科学家吴宇轩研究员在基因治疗方向的题为“Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells”的研究成果[1]。华东师范大学生命科学学院吴宇轩研究员和哈佛大学医学院及波士顿儿童医院曾静是该论文的共同第一作者。该研究证实通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术有望彻底根治由β-globin珠蛋白突变引发的系列遗传疾病。

一、研究背景

β-地中海贫血是一种由于β-珠蛋白(β-globin)亚基突变导致患者自身的成人血红蛋白(HbA)异常的遗传性疾病。镰刀状贫血(SCD)与β-地贫致病机理类似，都是β亚基突变导致的单基因遗传性疾病，主要症状为：HbA结构异常，红细胞变形，出现典型的镰刀形状，无法有效通过微循环，运输氧能力降低，出现贫血。不过镰刀状贫血在国内患者很少，主要发生在黑色人种中，在非洲黑人中的发病率最高，在我国的南方地区也发现有少数病例。

《中国地中海贫血防治蓝皮书(2015)》的数据显示，目前我国“地贫”基因携带者约3000万人，涉及近3000万家庭一亿人口，中度至重症地贫患者约30万人且正以每年约10％的速度递增。我国以南方地区多见，广西以12.22%～23.02%地中海贫血基因高携带率居我国首位，其次广东、海南等省。

治疗方式有限，急待新兴疗法出现

地中海贫血根据病情轻重，可以分为三类：轻度、中度和重度。通常情况下，轻型“地贫”无需特殊治疗。中间型和重型“地贫”主要采取以下方式：除铁治疗、输血治疗、骨髓造血干细胞异体移植、脾切除手术等。

其中，异体造血干细胞移植是根治“地贫”的方法，但费用花费巨大，且配型极其困难；其他方法只能够维持“地贫”患者生命，同样给家庭带来极大经济负担，且需消耗大量血液资源，患者生活质量极低，不能从源头上根治该疾病。

基因疗法有望成为新的治疗选择

近年来，基因疗法的出现给患者带来了希望，其最大的优势在于不需要捐赠，不需要异体移植，而且一次治疗可能导致永久性的“治愈”，有望取代目前并不完美的治疗方案。

目前，针对地中海贫血的基因治疗策略主要分为两种，基于慢病毒整合的方式和基于基因编辑的方式。策略为：递送功能性β-血红蛋白基因拷贝或基因编辑组分至患者的造血干细胞(HSC)，从此替病变的β-血红蛋白基因完成工作。

基于慢病毒整合

针对慢病毒整合，进展速度最快的是Bluebird Bio基因疗法LentiGlobin，针对输血依赖性β-地中海贫血症(TDT)和镰刀状贫血(SCD)的临床试验分别进行到III期和I/II期，已获得EMA的加速审评资格并且已向EMA提交了上市许可申请，有望于2019年率先在欧洲上市。

LentiGlobin是一种基于慢病毒载体的体外基因疗法，该疗法虽表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具有致癌风险；同时慢病毒中的表达原件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，极有可能无法达到终身治愈的目的。并且这种方法需要大量病毒，即意味着巨额的花费花费较高。

基于基因编辑

对比基于慢病毒整合的方式，基于基因编辑技术的基因疗法成为了一种可能成本更低、耐久性更佳的治疗手段。

在欧洲，CRISPR Therapeutics/Vertex公司利用CRISPR/Cas9基因编辑技术的在研基因疗法CTX001用于治疗TDT正处于I/II期临床试验中，这也是首个由制药公司发起的CRISPR临床试验，并且是欧盟批准的首个。2018年10月，美国FDA批准CTX001用于严重SCD的临床试验申请。

2019年2月25日，两家公司宣布第一名TDT患者已在I/II期临床研究中接受CTX001治疗。与此同时，它们正在研究用于治疗SCD的CTX001，并宣布第一名严重SCD患者已在美国参加I/II期临床研究，预计将在2019年中期输注CTX001。

不同于靶向导致疾病的缺陷基因，CTX001通过切割一种抑制胎儿血红蛋白(HbF)表达的BCL11A基因起作用，HbF是一种可以携带大量氧的血红蛋白，通常在出生时表达，成年后被置换为成人血红蛋白(HbA)。在体外，CTX001通过电穿孔引入患者自体造血干细胞，然后回输到患者体内，可以产生含有高水平HbF的红细胞，代替HbA起作用。

二、治疗机理

研究发现，胎儿血红蛋白HbF其构成为(α2γ2)，γ-globin具有和β-globin相似的功能，并且编码该蛋白的基因HBG在贫血患者中序列完好，但到成年期表达便会被沉默。因此，重新激活患者体内γ-globin基因的表达来弥补缺损的β-globin，被认为是治疗或缓解这类遗传性贫血的一个重要策略。

基因编辑(Genome editing)技术能够通过插入、缺失或替换的手段对基因组进行定点改造，能让正常基因替换突变基因，从而利用基因编辑技术重新开启胎儿期的γ珠蛋白的表达，代替有缺陷的β珠蛋白，因此很有可能成为缓解甚至治愈地贫的治疗方法。

BCL11A基因的表达与γ-球蛋白表达成负相关，提示在患者造血干细胞中靶向编辑BCL11A红系增强子会重新激活HbF的表达，再将高效编辑后的造血干细胞移植给患者重建造血，可产生高表达HbF的红细胞，且不会影响淋巴细胞的分化、成熟[2-5]。基于此，上面提到的CRISPR Therapeutics/Vertex也正在进行体外基因疗法的临床试验。

三、研究结果

基因治疗地贫示意图[6]

基于上述机理，最新研究首先通过比较不同的sgRNA优化编辑系统，实现了CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)在人CD34+造血干/祖细胞中的高效基因编辑。接着，将编辑过后的CD34+细胞体外红系分化后，发现BCL11A的表达水平显著降低，同时HbF的含量得到极大提升。

对多种地中海贫血类型的患者来源CD34+细胞进行编辑的结果发现，分化后的红细胞分化更加成熟、体积和形态都恢复至接近于健康细胞水平。

研究人员通过进一步优化Cas9原核表达载体和编辑系统，使得CD34+细胞在体外的编辑效率进一步提高到了98%，这样就可以使得CD34+细胞中的长期造血干细胞(LT-HSCs)得到有效编辑。

基因编辑的造血干移植小鼠体内后，可以显著提高红细胞的HbF水平

编辑后的造血干细胞移植至免疫缺陷小鼠体内4个月后仍然保持着90%以上的编辑效率，并且能在小鼠骨髓中成功重建人源血液系统，同时分化得到的红细胞含有高比例的HbF。另外，研究发现人长期造血干细胞LT-HSCs在被Cas9编辑后更倾向于被非同源末端连接(NHEJ)的方式修复，而非微同源末端连接(MMEJ)。

小鼠体内γ-globin表达水平在编辑前后对比

SCD患者的细胞编辑后，HbF水平提升且细胞恢复正常形态

最后，研究人员证明了镰刀状贫血病(SCD)人来源的CD34+细胞也能被高效编辑且在编辑后移植至小鼠体内重建人源血液系统，同时红细胞中HbF的提升水平足以帮助细胞恢复正常形态，抵抗镰刀化。

SCD来源CD34+细胞编辑后可抵抗镰刀化

深度测序发现，Cas9 RNP介导的基因编辑是一种极其安全的治疗方法

此外，研究人员还用CIRCLE-seq鉴定了一批潜在脱靶位点，并对潜在的脱靶位点和上百个可能的白血病突变位点进行了深度测序，结果显示这些位点并没有出现异常的插入或缺失，证实了Cas9 RNP介导的CD34+细胞中的基因编辑是一种极其安全的治疗策略。

CIRCLE-seq和深度测序鉴定和分析脱靶位点

四、临床意义

体外“地贫”患者造血干细胞、老鼠疾病模型、灵长类疾病模型等数据均显示对“地贫”疾病的彻底治愈完全有效。大量临床数据显示，HbF只需达到血红蛋白总量的30%，即可完全治愈地中海贫血疾病，而此策略（通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑β-地中海贫血和镰刀状贫血患者造血干细胞中的BCL11A增强子位点，并进行自体造血干细胞移植）所产生的HbF比例高达40%，因此足以起到治疗效果，从而有可能根治此类疾病。

与在基因治疗方面处于领先地位的BlueBird Bio公司的慢病毒疗法（名为LentiGlobin疗法正处于临床3期）相比，该论文的方法只需要在体外将Cas9蛋白和sgRNA通过电转染被导入患者自体造血干细胞，然后将其回输到患者体内，编辑后的造血干细胞可以分化为含有高水平HbF的红细胞，从而治疗血红蛋白相关的遗传疾病。

五、成果转化

综上所述，CRISPR/Cas9技术的出现使得我们可以通过重新开启胎儿期的γ珠蛋白的表达，从而代替有缺陷的β珠蛋白，达到缓解地贫症状的目的，具有很大的临床转化潜力。另外，目前国内还没有利用此方法治疗地中海贫血的临床实验，因此有望成为世界首批进入临床阶段的基因编辑治疗产品。

参考文献：

[1] Wu Y, Zeng J, Roscoe BP, Liu P, Yao Q, Lazzarrotto CR, Clement MK, Cole MA, Luk K, Baricordi C, Shen AH, Esrick EB, Manis JP, Dorfman DM, Williams DA, Biffi A, Brugnara C, Biasco L, Brendel C, Pinello L, Tsai SQ, Wolfe SA, Bauer DE (2018) Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells. Nature Medicine, 2019

[2] Y. Yu, J. Wang, W. Khaled, S. Burke, P. Li, X. Chen, W. Yang, N.A. Jenkins,N.G. Copeland, S. Zhang, Bcl11a is essential for lymphoid development and negatively regulates p53, Journal of Experimental Medicine, 209 (2012)2467-2483.

[3] J. Xu, C. Peng, V.G. Sankaran, Z. Shao, E.B. Esrick, B.G. Chong, G.C. Ippolito, Y. Fujiwara, B.L. Ebert, P.W. Tucker, Correction of Sickle Cell Disease in Adult Mice by Interference with Fetal Hemoglobin Silencing, Science, 334 (2011)993-996.

[4] D.E. Bauer, S.C. Kamran, L. Samuel, X. Jian, F. Yuko, L. Carrie, S. Zhen, M.C. Canver, E.C.Smith, P. Luca, An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level, Science, 342 (2013) 253-257.

[5] Canver, M.C. et al. BCL11A enhancer dissectionby Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192–197(2015).

[6] Lettre G, Bauer D E. Fetal haemoglobin in sickle-cell disease: from genetic epidemiology to new therapeutic strategies.[J]. The Lancet, 2016, 387(10037): 2554-2564.