近几年来，CRISPR引领的基因编辑热潮在科学界可谓是“卷起千堆雪”。就在刚刚，一个新的“惊涛”，再一次重重拍在基因编辑的海岸上，引起了业内广泛的关注和讨论。 

这个“惊涛”就是哈佛大学David Liu课题组在10月21日发表在Nature上的长文:“Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA”[3]。David Liu课题组于2016年和2017年先后开发出CBE[1]和ABE[2]这两个单碱基编辑工具，在单碱基尺度上为基因编辑提供了新的研究工具。而这篇新的文章，David Liu提出了一种名为PE （Prime Editors）的全新编辑工具。接下来邦耀实验室就带大家认识一下这个被广泛关注的新型编辑器。

David Liu教授

PE工具究竟长什么样？

不能任意编辑所有碱基、存在脱靶效应，是目前单碱基编辑技术面临的两大问题，为了解决上述问题，David Liu团队在gRNA和Cas9两方面进行了重大改造，开发出了PE工具（PE的基础仍然是CRISPR/Cas9系统），具体改造点如下：

1. pegRNA：pegRNA（prime editing guide RNA）是一段改造后的sgRNA，它在传统sgRNA的3'末端增加了一段RNA序列。这个RNA序列包括一段引物结合位点（Primer-binding site, PBS），用于与被切割的目标DNA链互补；还包括一段进行逆转录的模板（RT template）的序列，它与切口下游的DNA序列同源，且在RT序列上存在有相应的编辑突变（如点突变或插入缺失突变）（图1）。

图1. pegRNA的改造

2.融合蛋白：将nCas9（H840A）与M-MLV逆转录酶融合（图2）。

图2 . PE工具结构简图

PE如何工作？ 

根据我们上面总结的PE改造点，其实也较为容易去理解PE的工作原理。在pegRNA的引导下，融合蛋白会到达基因组上的目的序列，并对含PAM的靶DNA链进行切割（pegRNA的非互补链）。此后，PBS序列与被切割的目标DNA链互补配对，逆转录酶即从端口空缺处启示逆转录。逆转录产物（DNA）即包含我们所期待的编辑突变。这段逆转录DNA会入侵并进入基因组DNA，发生整合，并进行切口的修复。只要RT序列允许，那么就可以采用此原理完成碱基的点突变（任意转换或颠换）以及片段的插入和缺失（图3）。

图3. PE工具的工作原理图

这就是第一代PE:PE1。之后，David Liu课题组对PE1中的逆转录酶进行改造（D200N+L603W+T330P+T306K+W313F），建立了PE2。在PE2的基础上，在pegRNA下游增加未编辑的基因组DNA的识别位点，建立了PE3系统。增加识别编辑后的基因组DNA的sgRNA，就是更进一步的PE3b（图4）。在改造的过程之中，精准编辑的效率进一步提高。

 图4. PE3和PE3b的工作原理图

PE的优势及挑战 

PE工具的优势：

• 相比于传统的基因编辑工具（采用ZFN，TALEN，CRIPSR/Cas9等产生DSB进行HDR或NHEJ修复或通过base editing系统进行单碱基编辑），PE无需人为导入DNA模板（donor）便可有效实现所有12种单碱基的自由转换（任意转换或颠换），而且还能有效实现片段的精准插入与删除。根据文章报道，PE最多可插入44bp的碱基，可删除80bp的碱基。换句话说，可以通过这一类工具在不产生DSB的前提之下完成我们所希望得到的任意类型的编辑。

• 通过PE工具，David Liu课题组成功修正了镰状细胞贫血症在HBB中的一个A to T突变，同时也在HEXA细胞系中完成了戴萨克斯症（Tay Sachs disease）多出的4个碱基（HEXA 1278+TATC）的删除，证明了PE工具在多种类型的遗传疾病治疗中的强大应用潜力，David Liu团队在论文中表示，该技术“原则上可以修复75000种已知致病性人类遗传变异的89%”。（图5）。

• 相比于传统基因编辑工具，目前检测到的PE脱靶率较低，这说明PE系统的精准度更高。

图5. 人类遗传病的致病原因分布

Prime editing系统相比传统基因编辑技术，有着避免了DNA双链断裂、拓展适用范围等优势，同时也面临着一些挑战：

• 相比于ABE与CBE，PE系统的效率略低（图6）；

• 在PE3系统中，由于双sgRNA的存在，产生随机Indels的可能随之提高；

• PE可能无法实现基于CRISPR/Cas9所完成的非常大片段的DNA插入或删除（目前PE的插入或删除片段只有几十bp），所以它也不会完全取代现有的编辑工具；

• PE编辑所依赖的序列编码在一条RNA链上。这条RNA链越长，就越有可能被细胞内的酶破坏，从而降低编辑的效率。

图6. PE与ABE、CBE的效率比较

据报道，David Liu已围绕这项新碱基编辑工具Prime Editor创建了新公司 Prime Medicine，并且已以Broad Institute为申请人递交相关专利，同时以非排他性许可给Prime Medicine使用。除了Prime Medicine，David Liu作为创始人或联合创始人已拥有Beam Therapeutics、Pairwise Plants、Editas Medicine等七家科技公司，其中2017年5月与张锋等人联合创立Beam Therapeutics目前已提交上市申请。

整体上看，PE的问世打开了基因编辑的新大门。将PE与传统附加的体内外传递策略相结合，对于探索PE的潜力，使其能够进一步应用于遗传疾病的研究和治疗，是至关重要的。正如David Liu所言，在哺乳动物细胞的基因组中实现精确的目标转移、转位、插入和删除，且不需要DSB、供体DNA模板或HDR, PE提供了一种新的“搜索和替换”功能，极大地扩展了基因组编辑的范围。让我们一起期待，在未来的时间里，PE系统会展现出怎么样的风采吧！ 

参考文献：

[1] Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420-424.

[2] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017, 551(7681): 464-471.

[3] 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4