基因疗法以其“一次给药，终身受益”的优势越来越受到医疗市场的青睐。截至目前，欧洲药品管理局（EMA）、美国食品药品管理局（FDA）及中国国家食品药品监督管理总局（NMPA）等机构至少已批准13种基因治疗产品上市，同时还有2500多项细胞和基因治疗正在进行临床试验。2019年8月，国际顶级期刊《新英格兰医学杂志》（简称NEJM）发表了题为《Gene Therapy》的最新综述，从基本原理出发，介绍了目前为止基因治疗的临床应用和上市药物，并着重讨论了基因治疗现阶段存在的问题和挑战[1]。本文基于这篇综述，重点从病毒载体的角度来介绍一下当前基因治疗的发展现状。

01、传统药物面临挑战，基因药物蓄势待发

现代医学目前还以化学疗法，放射疗法和外科手术为主。其中许多药物都是化学合成药剂，旨在改变身体的化学反应并产生依赖性，并且通过减少疾病的症状和延长患者的寿命来实现暂时的缓解。然而，这些传统药剂面临许多挑战：包括溶解度和生物利用度低，体内物理化学性质不稳定，循环半衰期短，体内渗透性低，组织分布性差以及高剂量易引起毒性。

以蛋白类药物为例，基于蛋白质和肽类的药物已成为目前市面最常用的治疗药物，目前全世界有近380种市售药物。然而，将治疗性蛋白质引入患者体内的一个不利因素将会导致严重的免疫反应，炎症和发热症状。为了解决这一系列的问题，高质量治疗性蛋白质的生产工艺变得极为复杂，但是目前开发治疗性蛋白的工艺涉及5000多个关键步骤。因此，开发化学和蛋白疗法的不可预测性太高，时间和投入成本太大。

基因疗法能实现治疗性蛋白的长期表达和组织特异性表达，无需药物干预，放疗或手术治疗，即可从根源上解决传统疗法存在的一系列问题。并且这一新兴的治疗方法可针对单基因遗传病，心血管疾病，免疫缺陷性疾病和癌症等多种疾病。

02、基因治疗的基本原理及分类

基因治疗是指将功能基因递送到患者体内，以替换或纠正功能障碍，从而治愈疾病。鉴于基因递送方式的不同，基因治疗主要分为离体和在体基因疗法两大类：（如下图所示）

图1. 基因治疗的2种方式（体外-左；在体-右）[1]

1. Ex vivo

▲ 又称离体基因治疗，从患者体内分离细胞，将整合载体在体外导入这些细胞，进行基因工程改造，随后再回输到患者体内。

▲ 治疗疾病的代表：CAR-T细胞免疫疗法[2]、地中海贫血和镰状细胞贫血。EMA获批的由BlueBird Bio公司开发的Zynteglo就是一种基于慢病毒载体的离体基因疗法[3]。

2. In vivo

▲ 又称在体基因治疗，是将非整合载体直接注射给患者，使得功能性矫正基因被递送至患者体内，恢复疾病正常表型。

▲ 治疗疾病的代表：先天性黑朦症[4]，脊髓性肌萎缩症[5]和血友病[6, 7]等。

二者各自优势和挑战

离体基因治疗：由于利用自体细胞，因而不会产生免疫反应；同时还可在体外筛选到高效转导以及无脱靶的细胞，进而实现高效安全的治疗效果。但由于步骤繁琐，细胞活力低等缺点也受到一定的局限。此外，整合型载体的使用更易引起体内的随机插入，进而产生癌变也是亟需解决的问题之一。

在体基因治疗：由于其操作简便，对于一些体外无法培养的细胞类型是最优选择。但由于体内编辑的不确定性，无法避免很多随机整合或脱靶等事件，并且一些病毒载体还会使机体出现危及生命的免疫反应。因此，开发和优化新型的基因递送载体系统，使治疗基因能更安全有效地递送到靶向细胞或组织，将极大地促进基因治疗在临床应用中的进程。

03、理想的载体是基因治疗的关键

如上所述，不管是体内还是体外基因治疗，理想载体的选择是基因治疗成败的关键，它们应该具备以下几个特点：

▲ 有足够的空间来递送大片段的治疗基因；

▲ 具有高转导效率，能感染分裂和非分裂的细胞；

▲ 能靶向特定的细胞，且可以长期稳定表达转基因；

▲ 具有较低的免疫原性的或致病性，不会引起炎症；

▲ 具备大规模生产的能力。

因此，寻找合适的载体一直是基因治疗的重要研究领域。目前针对基因治疗的载体一般分为病毒和非病毒载体。下图展示了临床试验中各种递送载体的占比情况，病毒载体是基因疗法最常用的递送系统（主要包括ADV、RV、AAV等），它也是世界上第一个用于基因治疗的临床研究载体。

图2. 不同载体的临床试验占比

1. 非病毒载体：主要通过物理和化学方法来转导治疗性遗传物质，包括针，基因枪，电穿孔，声孔效应，光致成像，磁场转换，加氢，机械按摩，脂质体，磷酸钙，二氧化硅和金纳米粒子等。然而，由于它们操作复杂且存在固有的缺陷，其在基因治疗的效果无法满足临床的需求。

2. 病毒载体：相较于非病毒载体，病毒载体更符合理想载体的要求，因此，大量研究人员正集中开发新型的病毒载体，以求基因治疗能够安全有效地治愈人类疾病。

截至目前已被用于基因治疗的病毒载体主要有以下几种：

逆转录病毒载体（RV）

▲ 一类可将RNA基因组反转录成双链DNA并整合到宿主细胞染色体中的病毒。

▲ 分类：两种最常见的逆转录病毒类型是γ逆转录病毒和慢病毒，它们分别来自MLV和HIV-1。

▲ 适用范围：成熟的RV可以感染多种体细胞，包括胚胎干细胞，造血干细胞和神经干细胞。利用活性核元件，这些载体可以只将治疗基因转导到增殖细胞中，因此非常适合用于特异性靶向癌细胞。

▲ 装载容量：可达8kb。

▲ 缺点：RV的一个重大隐患是整合酶可以将病毒的基因组插入到宿主基因组中的任何位置，可能会导致某些关键基因的失活（插入突变）或者是导致细胞无限增殖（癌变）。

1. RV在临床试验中最新进展：

迄今为止RV载体已进行了500多项基因治疗的临床试验，如癌症，地中海贫血，HIV，ADA-SCID，黑素瘤，WAS等，下表罗列了目前已开展的基于RV的重要临床试验研究：

2. RV载体用于临床试验存在的主要问题和解决方案：

▲ 由于免疫反应是RV病毒介导的基因治疗的主要障碍，因此设计可以破坏补体系统的病毒载体至关重要。

▲ RV的LTR用作各种核蛋白的启动子，增强子，结合位点，染色质调节剂和多腺苷酸化信号。因此，应用基因工程和CRISPR技术可能规避插入突变的问题。另外通过在治疗期间使用非整合的RV载体或整合酶抑制剂也可以避免该问题。

▲ 开发引导和监测宿主细胞染色质中转基因插入的技术也将有助于RV介导的基因治疗。

▲ 尽管RV载体可以递送高达10kb的转基因序列，但高滴度病毒的制备，染色质结构以及插入位点附近表观遗传的修饰仍然是临床应用存在的主要问题。

▲ 由于病毒感染取决于靶细胞表面受体和病毒包膜蛋白的表达，因此设计和构建有效组织特异性重组RV载体对于良好的临床结果是必要的。

腺病毒载体（ADV）

▲ 第一个基因治疗开发的病毒载体，于1990年被批准用于临床试验。它于1953年首次从人类腺体组织来源的细胞培养物中分离出来，因此称为腺病毒。含有多个家族成员，是一种无包膜的双链DNA（dsDNA）病毒，也称为腺病毒科。

▲ 分类：ADV到目前已改进到第三代病毒系统，也称为无病毒基因组或辅助依赖性ADV载体，缺乏除ψ和ITR序列外的所有病毒基因序列。能维持长期的转基因表达能力，以及较少的复制病毒颗粒的污染。其免疫原性也低于第一代和第二代载体。

▲ 装载容量：高达37kb。

▲ 缺点：强免疫原性。

1. ADV在临床试验中最新进展：

ADV载体在整个病毒介导的临床研究中的比例约24%（如上图所示），主要集中在疫苗接种和溶瘤治疗，也正被测试用于疟疾，炭疽，HIV，流感，乙型肝炎和丙型肝炎，以及严重血友病以及心血管和更多疾病的临床试验。下表罗列了目前已开展的基于ADV的重要临床试验研究：

2. ADV载体用于临床试验存在的主要问题和解决方案：

大量临床试验得到了令人鼓舞的结果，特别是在癌症治疗中，预计ADV介导的基因治疗不久的将来会在根除癌症中发挥重要作用。虽然ADV介导的基因治疗较其他系统具有独特的优势，但必须解决以下几个问题才能真正发挥其在临床治疗中的真正潜能：

▲ 开发可避免内源性信号转导途径的激活和细胞因子的产生的新型ADV是至关重要的，因为抗体免疫应答的产生可能会使临床操作复杂化。

▲ ADV的有效感染对于整合素和CAR蛋白在靶细胞或组织上的表达的依赖性限制了其在更多疾病中的治疗前景。因此，开发高特异性感染的新型ADV载体也是非常有必要的，以求提高转基因表达达到治疗水平，诱导更低的器官毒性和炎症，并且可以在体内更加容易检测。

▲ 了解疾病特异性生物标志物，设计和工程化改造携带细胞或组织特异性受体结合表位的新型ADV衣壳也可以减少临床副作用的产生。

▲ 由于ADV中和抗体的存在因患者而异，因此设计和开发患者个性化的特异性衣壳将是未来ADV治疗疾病的趋势。

▲ 开发抗血清蛋白失活的ADV载体将有助于提高静脉内注射病毒的治疗效果，但仍需要制定剂量相关毒性的解决策略。

▲ 复制感染病毒的污染仍然是治疗性ADV制剂大规模生产中的重大问题。因此，需要进一步推进ADV的纯化工艺以及基于AV的基因递送技术的研发，以充分发挥其基因治疗的潜力。

腺相关病毒载体（AAV）

▲ 一类具有单链和无包膜的DNA的病毒，可感染分裂和非分裂细胞。AAV以游离形态存在于细胞中的能力使它们成为基因治疗的优良候选者。这些病毒的另一个显著特征是它们在没有腺病毒和疱疹病毒作为辅助病毒的情况下对人体不具有致病性。在没有辅助病毒的情况下，这些病毒可以将它们的遗传物质插入到19号染色体上的特定位置。

▲ 分类：AAV具有多种常见血清型，100多种病毒变种。不同血清型的AAV具有不同组织特异性。

▲ 装载容量：不超过5kb。

▲ 缺点：人体本身就是AAV的天然宿主，因而会存在抗AAV血清型的中和抗体。有限的包装容量限制了其在更多疾病治疗中的应用。

1. AAV在临床试验中最新进展：

目前AAV载体已被用于200多项临床试验来治疗多种疾病，占所有基因治疗临床研究的8.1%。包括A/B型血友病、先天性黑蒙症、遗传性脉络膜视网膜营养不良、全色盲和Leber的遗传性视神经病变（LHON）。此外，还有许多临床试验正在测试用AAV来治疗溶酶体贮积症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、癫痫、1型脊髓性肌萎缩、异染性脑白质营养不良、芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症（AADC），以及巴特病等。下表罗列了目前已开展的基于AAV的重要临床试验研究：

2. 临床试验研究AAV介导的几类重要疾病介绍：

▲ 癌症基因治疗：许多AAV载体正被用于测试抗血管生成，细胞毒性，细胞因子和肿瘤抑制基因，小RNA，抗原和抗体的表达来治疗癌症。大量临床前研究显示，使用AAV介导的基因治疗可改善肿瘤的消退[8, 9]。

▲ 靶向肝脏基因治疗：以肝脏或其他器官为目标对AAV载体进行的全身性血管内给药已在多重度遗传病中获得了良好的临床结果。通过向患者体内递送FIX对严重B型血友病的成功治疗被认为是基因治疗临床应用的里程碑[7]。在正在进行的I / II期临床试验中，FVIII和FIX分别被递送给A型和B型血友病患者。另外针对粘多糖血症的治疗药物SB-318和SB-913的I / II期临床试验也正在进行中。

▲ 视力损伤基因治疗：视网膜作为一个相对“免疫特赦”的器官被视为载体介导的基因治疗的理想位点，仅需较小的剂量就可达到最佳的效果。基于AAV介导的先天性黑朦症基因治疗药物Luxturna™已获批上市[4]。2019年7月，Edita公司开展了针对先天性黑蒙症10-型的基因治疗的I / II期期临床研究。这将有可能成为全球第一个获批上市的基于AAV介导治疗10-型莱伯氏先天性黑朦疾病的在体 CRISPR 基因编辑药物[10]。

▲ 脊髓性肌萎缩基因治疗：基于AAV介导的基因治疗的另一个成功案例是脊髓性肌萎缩的治疗，由运动神经元存活蛋白-1（SMN1）基因突变是引发该疾病的主要原因。2019年美国美国FDA批准了由Novartis公司AveXis Inc.开发的基于AAV介导体内表达SMN1蛋白的药物Zolgensma[5]。

3. AAV载体用于临床试验存在的主要问题和解决方案：

尽管AAV载体是安全非致病的，但它们在基因治疗中的应用受制于有限的装载容量（不超过5Kb），衣壳蛋白引起的免疫原性，生产工艺困难，大剂量高度纯化载体的需求，普遍的趋向性以及在人群中存在广泛的抗AAV抗体（208-211）。基于AAV的基因治疗是目前最为安全有效的治疗方式，因而优化AAV病毒载体对于基因治疗在临床中的应用至关重要：

▲ 由于AAV主要是衣壳与靶细胞相互接触，因此，更好地理解T细胞对各种AAV血清型的反应将减少炎症、免疫应答和其他病毒颗粒相关的副作用、设计和开发更多嵌合衣壳蛋白对于构建组织特异性的病毒颗粒是至关重要的。

▲ 更好地理解AAV颗粒在疾病特异性环境中潜在的细胞内转运机制将有助于开发改善基因递送效率的策略。对于患者通过免疫赦免部位（如中枢神经系统，粘膜表面，眼睛，胎盘，胎儿，睾丸和关节软骨）注射AAV可能是避免T细胞反应的更好选择。

▲ 尽管AAV载体被证实在不整合到宿主的染色体中可实现长达1年的治疗基因的表达，但应用CRISPR / Cas9技术将解决长期表达和诱变的问题。

04、已上市的基因治疗药物

随着病毒递送载体和基因编辑技术的进步，自2003年以来，至少有十几种基因治疗产品问世（如下图所示）：

图3. 近年来上市的基因治疗药物

1. Gendicine™是全球首个获批的基因治疗药物，由深圳SiBiono GeneTech开发，用于治疗携带p53基因突变的肿瘤患者。Gendicine™是一种携带野生型p53基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-p53)，可通过刺激肿瘤细胞中的凋亡途径，增加肿瘤抑制基因和免疫应答因子的表达进而杀伤肿瘤。中国国家食品药品监督管理局于2003年10月16日批准了Gendicine™用于头颈部鳞状细胞癌的治疗[11]。

2. Oncorine™是另一种携带p53基因治疗头颈癌的基于复制缺陷ADV的药物，于2005年在中国上市，由上海双威生物科技有限公司开发。Oncorine™是通过重组的方式删除人5型腺病毒E1B-55kD和E3区部分基因片段而获得的一种溶瘤性腺病毒，它可在p53功能缺陷的肿瘤细胞中选择性复制而诱导肿瘤细胞死亡，而不会对正常细胞产生明显毒副作用[12]。

3. Rexin-G™是一种嵌合逆转录病毒载体，装载有细胞杀伤性显性负性的细胞周期蛋白G1基因以靶向并杀死实体肿瘤，于2005年获得菲律宾FDA的批准。由Epeius Biotechnologies Corporation开发的Rexin-G™被指定为美国FDA作为胰腺癌的孤儿药。最近的临床研究结果证实了该药物在安全性，抗肿瘤性以及增加患者生存时间和存活率的潜力[14]。

4. Imlygic™是一种用于治疗无法通过手术去除的黑色素瘤的转基因HSV疗法，命名为T-VEC（Imlygic™），于2015年上市，是第一个也是唯一FDA批准可直接注入黑色素瘤的基因药物。T-VEC可直接杀死转移性黑色素瘤细胞并增强对它们的免疫应答。这种先进的溶瘤病毒在肿瘤细胞中复制并合成粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），从而导致肿瘤抗原的肿瘤裂解和释放，从而引发免疫反应。T-VEC在欧洲和澳大利亚已被批准用于黑色素瘤的治疗[13]。

5. Strimvelis™[15]是另一种基于逆转录病毒用于治疗超罕见的免疫缺陷综合症（ADA-SCID）的药物，于2016年被EMA批准上市。它是第一个用于治疗ADA-SCID的体外干细胞基因疗法，也是第二个被欧盟批准上市的基因疗法。Strimvelis™利用RV将ADA基因拷贝插入到患者骨髓提取的干细胞染色体中。然后将携带ADA基因的干细胞重新注入患者体内并可表达腺苷脱氨酶，从而修复患者的免疫系统。尽管临床结果显示Strimvelis™针对疾病的缓解率可达100％，但目前仍倾向于使用具有较低插入诱变风险的自失活逆转录病毒载体，如慢病毒载体。

6. Zalmoxis® 是另一种基于供者来源T细胞的自杀基因免疫疗法，于2016年被EMA有条件性批准用于治疗部分白血病和淋巴瘤。该方法使用RV遗传修饰异体来源的T细胞以表达1NGFR和HSV-TK Mut2自杀基因，因而可以随时使用更昔洛韦（ganciclovir）药物杀死引起不良免疫反应的T细胞。带有“自杀基因”的T细胞表达前药转换酶HSV-TK，后者可磷酸化激活更昔洛韦的细胞毒活性，从而诱导T细胞“自杀”，防止可能出现的GVHD进一步恶化[18]。

7. Kymriah™是一种基于慢病毒的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）来治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）和B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的基因疗法，于2017年被美国FDA批准上市。Kymriah™是一种新型免疫细胞疗法，它使用患者自身重编程的T细胞编码转基因CAR来鉴定和消除表达CD19的恶性和非恶性肿瘤细胞，整体的治疗缓解率可达83％[16]。

8. Yescarta™是另一种基于逆转录病毒的CAR-T细胞免疫疗法，由吉利德公司Kite开发，并于2017年获得FDA批准。使用NHL患者自身T细胞并使用RV进行遗传修饰以产生与CD28和CD3-zeta共刺激结构域连接的抗CD19的CAR，以帮助对抗淋巴瘤。仅在美国，约有7,500名难治性DLBCL患者有资格接受Yescarta™治疗[17]。

9. Luxturna™于2017年被FDA批准作为治疗Leber先天性黑朦的孤儿药，也是首个用于治疗失明的基于病毒类的药物。携带有野生型RPE65的AAV2被用于治疗双等位基因RPE65突变相关的视网膜营养不良的患者，可在几个月内恢复其视力[4]。

10. Spinraza®已成为首个批准用于治疗罕见且致命的脊髓性肌萎缩症（SMA）的治疗方法。Spinraza®是一种反义寡核苷酸（ASO），治疗由5号染色体上SMN1基因突变所引起的脊髓性肌萎缩症。Spinraza®改变SMN2前mRNA的拼接，从而增加全长SMN蛋白的生产，可有效增加SMA患者中全长SMN蛋白的数量。目前的临床数据显示Spinraza®在治疗SMA方面的显著疗效和广泛的适用性。此外，由Novartis公司AveXis Inc.开发的基于AAV介导的在患者中表达SMN1蛋白的药物Zolgensma已于2019年被美国FDA批准用于治疗SMA[19]。

11. Zynteglo是由Bluebird Bio开发的一款基于慢病毒的自体干细胞疗法，于2019年获得EMA有条件批准用于治疗12岁及以上的非β0 /β0基因型输血依赖性β-地中海贫血(TDT)患者。通过慢病毒载体将具备功能的人βA-T87Q-珠蛋白基因导入到从患者体内取出的造血干细胞中，再将这些干细胞回输到体内，使患者能自主生成β-珠蛋白，从而消除或大幅降低继续输血治疗的必要性。临床数据显示，该疗法可以使特定基因型TDT患者免于输血长达3.8年[3]。

05、新兴基因编辑技术推动临床发展

截至目前，基于基因疗法的临床试验及上市药物主要以外源基因增补的方式通过病毒递送来治疗疾病，虽然这一方式取得了显著疗效，但仍然无法实现疾病长期治愈的可能，这主要归因于病毒载体（如慢病毒）插入突变，ADV载体显著的肝毒性以及AAV载体以游离态形式会随细胞分裂增殖而丢失，或因产生的迟发性免疫反应所清除等诸多因素。为了解决这一问题，新兴的以核酸内切酶为基础的基因编辑技术（如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）正被科学家们开发用于疾病的治疗。

基因编辑技术通过核酸内切酶靶向切割基因组形成DSBs，通过NHEJ的方式产生Indel导致基因敲除，在有模板存在的条件下可通过NHEJ或HDR的方式发生靶向整合，对异常基因进行定点修复或将治疗基因靶向整合到基因组中，成功编辑的细胞可以传递给子代，以实现疾病的长期修复效果。

随着病毒载体和基因编辑技术的不断优化，基于基因编辑技术的多项临床试验也陆续在进行中，其中包括：

▲ 利用锌指核酸酶（ZFN）治疗HIV-193的临床试验，以及三项由ZFN 介导治疗基因体内插入肝细胞白蛋白位点治疗粘液多发性硬化症I/II型和B型血友病的临床试验。

▲ 针对急性髓性白血病和母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤的靶向 CD123 的同种异体 TALEN 编辑的CAR-T 细胞的早期试验也已经启动。

▲ 最近，由Editas联合制药公司Allergan共同开启了通过AAV和CRISPR敲除CEP290内含子突变治疗10型先天性黑朦症的1/2期临床试验[10]。

另外还有许多基因编辑治疗方法尚处于基础研究阶段，未来有希望进入临床来治疗更多疾病。基于基因编辑技术的拓展应用，如表观遗传调控以及目前最火热的单碱基编辑技术的开发应用也势必将会促进基因编辑技术在临床治疗中的广泛应用。

基因疗法的安全性及展望

基因疗法目前主要以病毒载体递送为主，对病毒载体最为关注是免疫反应、脱靶效应、炎症和插入诱变的风险。免疫应答可能使病毒治疗效率降低，或者由此产生的抗体可能使二次给药无效。炎症反应被认为是1999年高剂量腺病毒引起Jesse Gelsinger死亡的主要原因[20]。为了降低这些安全问题，为患者量身定制病毒剂量可以更好地控制这种风险。此外，插入诱变是基因治疗领域必须克服的主要困难。对于随机整合的载体，例如RV，存在将基因插入肿瘤抑制基因或激活癌基因的风险。为了解决这一问题，可以使用非整合型载体。另外，还可以制备不含自身启动子的自失活载体，利用细胞中的内源启动子可显著降低遗传毒性，是传统整合载体更安全的替代品。为了解决AAV包装容量的限制，使用双AAV载体系统可实现更大基因递送的能力。

基因治疗的未来会朝着更安全、更高效的载体工程方向发展，结合多种现有策略，如病毒载体与基因工程技术相结合，针对患者进行个性化基因治疗。总之，基因治疗的进展为许多迄今无法治愈的疾病带来了令人兴奋的新治疗机会。然而，要克服这类新型药物带来的困难险阻并实现其全部治疗潜力，我们仍需要强有力且持续的合作努力。

随着更多基因治疗临床试验的进行，今后将会出现更多的基因治疗药物批准上市，更多类型疾病的治疗将不再是梦想。然而，我们也要认识到目前已上市的基因治疗药物所存在的问题，诸如审批流程复杂、价格昂贵以及需求量低等，建立合理的审批流程、制定合适的定价策略，将会为基因治疗药物的发展提供充足的保障。

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