前言

抗原 (靶点)的选择一直是CAR-T领域的研究重点，在上一期已详细介绍。但是仅仅有合适的抗原，缺乏共刺激信号，T细胞往往会未老先衰，起不到抗肿瘤的作用。最新的各种证据已表明，除了CAR结构中的胞外域，其共刺激域也能够对CAR-T细胞的活性，以及最终的疗效和毒性产生很大影响。也就说在CAR-T的结构中，任何一个部件都起着关键作用，所以本期我们就来看看CAR-T结构组成及其功能。

嵌合抗原受体（CAR，Chimeric antigen receptor）-T细胞免疫疗法是一种过继性细胞免疫疗法，它是利用基因技术，在T细胞内导入一个可以将CAR表达于其表面的融合基因，并使T细胞发挥作用，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，打破宿主免疫耐受状态，靶向杀伤肿瘤细胞。

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CAR-T杀伤肿瘤的流程视频（来自Kite官网）

CAR主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）及一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成。胞内结构域由共刺激结构域（Costimulatory Domain）和信号转导结构域（Signaling Domain）构成[1]。

图1. CAR的结构组成及作用机理

01、胞外结构域

1. 抗原识别结构域（scFv）

▲ 结构组成：抗原识别结构域是CAR特异性结合肿瘤抗原的基础，其主要结构是scFv，由单克隆抗体的轻链（VL）和重链（VH）通过多肽连接而成，保留有抗体对抗原的特异性和亲和力[2]。

▲ 功能：scFv赋予了T细胞特异性识别并结合靶抗原的能力，与未经修饰的天然TCR-T细胞相比，其对靶抗原的亲和力显著提高。CAR-T细胞通过scFv对靶抗原的识别结合不依赖MHC抗原呈递，一方面避免了肿瘤细胞通过调节MHC分子发生逃逸，另一方面赋予了CAR-T细胞识别非肽抗原的能力[3]。

▲ 研究进展：目前大部分CAR-T研究是靶向TAA的，如包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA等，也就是说临床上主要是针对这些靶点来开发抗体。不过目前CAR-T临床研究所用的scFv多源于小鼠，这无形中增加了宿主对CAR-T细胞的免疫排斥反应，发生细胞毒性或降低了CAR-T的持续性[4]。因此，开发人源化或全人源的抗体来源的scFv，降低CAR-T细胞的免疫原性，是CAR-T研究面临的关键问题之一。

2. 铰链区（Hinge）

▲ 结构组成：铰链区连接scFv和跨膜结构域，大多数CAR的铰链区由IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区衍变而来。铰链区的长度取决于靶细胞抗原表位的位置及暴露程度。

▲ 功能：多项研究表明，CAR-T细胞活化与铰链区长度有关。调整铰链区的长度可以使CAR-T细胞和靶细胞处于最佳距离，在抗原抗体结合过程中避免大型磷酸酶的作用减弱CAR信号。然而，在某些情况下，抗原表位可能相对不可接近，需要使用更长的铰链区，使scFv可以克服空间位阻，有效结合抗原[5]。因此，抗原表位不同，铰链区的最佳长度也不同，在靶向新抗原时，可能需要相应地调整铰链区的长度。

02、跨膜结构域

▲ 结构组成：跨膜结构域将CAR的细胞外结构域与细胞内信号转导结构域连接，并将受体锚定到T细胞膜上。常用的跨膜结构域来源于CD4，CD8α，CD28和CD3ζ[6]。

▲ 功能：如CD3ζ跨膜域能够使CAR形成同源二聚体或与内源TCR形成异二聚体，增强CAR-T细胞活性，但也正是由于其不需要与内源TCR结合即可高度活化T细胞，而逐渐被弃用。CD8α和CD28的跨膜域由于能够促进CAR在细胞表面表达，目前在多数临床试验中采用[7]。

03、胞内结构域

1. 共刺激域（Costimulatory Domain）

▲ 结构组成：共刺激域通常来自CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)。

▲ 功能：共刺激域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。如CD28共刺激域使CAR-T细胞依靠糖酵解代谢，促使CAR-T细胞向效应T细胞分化。而4-1BB共刺激域促进线粒体生成，增强呼吸作用和脂肪酸氧化，抗原刺激后，CAR-T细胞优先分化为中央记忆T细胞[1]。

▲ 研究进展：不过究竟是哪个共刺激结构域更好？科学家们仍在一直探索，如2018年，《Science Signaling》期刊上一篇文章比较了这两种结构，结果发现：CD28表现出更快、更强的信号活动，而4-1BB则相对更慢、更温和。但是，4-1BB有着“延长T细胞寿命并维持其抗癌作用”的潜在优势[8]。

2. 信号转导结构域（Signaling Domain）

▲ 结构组成：信号转导结构域通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεＲIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs）[1]。

▲ 功能：发挥T细胞信号转导功能。

04、CART的发展历程与未来趋势

了解了上述各个部件后，是否对于CAR的功能更加了解呢？简单来说，当T细胞表达某种嵌合抗原受体时，它们能被特定的抗原激活，启动ζ信号，ζ信号和其他信号（CD28或者OX40的可以启动增殖或者存活信号）共同作用可以引起T细胞的激活，靶向杀伤肿瘤细胞。

目前根据CAR结构是否含有共刺激结构域，可分为3代CART，即无共激区/单共激区(CD28或4-1BB)/双共激区(CD28+4-1BB)[9]。

图2. 三代CAR结构比较[9]

▲ 第一代CAR-T细胞：胞内域CAR结构中只有信号转导结构域，CAR-T细胞活性差，体内存活时间短；

▲ 第二代CAR-T细胞：引入了共刺激域 (如：单共激区CD28或4-1BB)，可使CAR-T细胞持续增殖并释放细胞因子，增强抗肿瘤活性；

如已上市的两款药物均为二代CART，如诺华的Kymriah的共刺激结构域是4-1BB，而吉利德的Yescarta的共刺激区是CD28。

表1. Kymriah和Yescarta结构比较

▲ 第三代CAR-T细胞：包含两个共刺激域(如：CD28+4-1BB)，可使T细胞持续活化增殖，增强杀伤肿瘤细胞作用；

一些临床前研究表明，与第二代CAR-T细胞相比，第三代CAR-T细胞表现更好；然而，有些研究则没有发现差异；甚至在某些情况下，第三代CAR-T细胞的表现比第二代更差。这说明体外测量的CAR-T细胞效价并不能总是准确预测其在体内的功能[10-12]。

虽然，目前二代CAR-T技术的研发仍处于主流地位，但各大公司仍在积极探寻新的方向，例如同种异体CAR-T（UCAR-T）设计，可调控CAR活性的设计等等。随着临床研究的深入，研究者们除了研发新的识别肿瘤靶点，也在安全性、CAR-T体内持续性、识别多靶点等多个方向解决肿瘤复发、可能发生的副反应、实体瘤疗效差等诸多问题。未来，随着成本的下降和医保的逐渐纳入，相信CAR-T细胞治疗可以成为普通百姓可以用得起的治疗方式。谈癌色变的时代终将过去，人类生命健康事业已经起航！

参考文献：

1. Stoiber, S. et al. Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. Cells 2019, 8, pii: E472.

2. Bird, R.E. et al. Single-chain antigen-binding proteins. Science 1988, 242, 423-426.

3. Posey, A.D. et al. Engineered CAR T cells targeting the cancer-associated Tn-glycoform of the membrane mucin MUC1 control adenocarcinoma. Immunity 2016, 44, 1444-1454.

4. Maus, M.V. et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol. Res. 2013, 1, 26-31.

5. James, S.E. et al. Antigen sensitivity of CD22-specific chimeric TCR is modulated by target epitope distance from the cell membrane. J. Immunol. 2008, 180, 7028-7038.

6. Zhang, T. et al. An NKp30-based chimeric antigen receptor promotes T cell effector functions and antitumor efficacy in vivo. J. Immunol. 2012, 189, 2290-2299.

7. Kochenderfer, J.N. et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood 2010, 116, 4099-4102.

8. Ramello, M.C. et al. An immunoproteomic approach to characterize the CAR interactome and signalosome. Science Signaling 2019, 12, pii: eaap9777.

9. June, C.H. et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science 2018, 359, 1361-1365.

10. Zhong, X.S. et al. Chimeric antigen receptors combining 4-1BB and CD28 signaling domains augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL activation and CD8+ T cell-mediated tumor eradication. Mol. Ther. 2010, 18, 413-420.

11. Yi, Z. et al. Optimizing EphA2-CAR T cells for the adoptive immunotherapy of glioma. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2018, 9, 70-80.

12. Abate-Daga, D. et al. A novel chimeric antigen receptor against prostate stem cell antigen mediates tumor destruction in a humanized mouse model of pancreatic cancer. Hum. Gene Ther. 2014, 25, 1003-1012.