基因治疗（Gene Therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。目前已在癌症、遗传性疾病如地中海贫血，镰刀状贫血症、血友病及先天性黑蒙症等多种疾病中表现出巨大的治疗潜力。基因治疗以其一次给药终身治愈遗传疾病的独特潜力让一切不可能变为有可能。

癌症和罕见病是目前基因治疗聚焦最多的领域

根据Pharma projects在2018年的报告[1]，目前基因治疗类别主要涉及到：癌症，单基因罕见遗传病，心血管疾病，传染病等，癌症和罕见病是当前基因治疗临床研究最多的两个领域，下图展示了截止2017年基因治疗的临床试验适应症的数目。

图1：截止2017年基因治疗的临床试验适应症数目[1]

基因治疗如何分类？

广义的基因治疗是指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。而狭义的基因治疗是指将发挥正常功能的基因以修正或置换原有缺陷基因的方式以达到治疗的目的。

目前基因治疗主要分为以下三类，包括根据治疗途径、操作方式和靶细胞进行分类。

一、根据载体给药途径可分为体内和体外基因治疗两种（图2）：

1. 体内途径（in vivo）（原位细胞基因治疗）：利用非病毒或病毒载体（或是基于病毒和基于基因编辑的方式）直接将治疗基因递送到患者病患部位，从而治疗疾病。这一方法操作方便，对于一些体外无法培养的细胞类型是最优选择。但由于体内编辑的不确定性，很多随机整合或脱靶等事件无法避免，且一些病毒载体会使机体出现危及生命的免疫反应。

2. 体外途径（ex vivo）（患者细胞离体被修饰，然后再移植回来）：直接取患者自身的病变细胞，在体外通过基因导入的方式修饰病变细胞，使其能高效表达治疗型蛋白，然后体外扩增，最后回输到病人体内达到治疗疾病的目的。这一方法可在利用自体细胞不会产生免疫排斥等免疫反应，还可在体外筛选到高效转导以及无脱靶的细胞，实现高效安全的基因治疗效果。但是由于步骤繁琐，细胞活力低等缺点也受到一定的局限。

体内外基因治疗的主要区别因素之一是载体的选择（图3）。如上所述，载体可以分为整合型载体和非整合型载体。那么如何选择呢？

l 当将遗传物质引入干细胞时，优先使用整合型载体，这样供体的DNA将被整合到干细胞的基因组中，在细胞分裂的过程中将被复制，从而遗传物质能被传递到所有子代细胞。

l 对于体内基因治疗而言，则通常靶向有丝分裂后的细胞。在这些细胞中，由于它们不会再分裂，只要导入的外源基因在细胞中稳定存在，就可以实现长期表达；稳定的游离体足以驱动外源基因的细胞周期性表达。

图2 基因治疗的体内外途径【2】

目前大多数用于遗传疾病的基因治疗策略主要围绕两种载体：

1) 用于体外基因转导到造血和其他干细胞的慢病毒（LV）载体：如bluedird Bio公司；LentiGlobin是一种基于慢病毒载体的体外基因疗法，该疗法虽表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具有致癌风险；同时慢病毒中的表达原件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，极有可能无法达到终身治愈的目的。并且这种方法需要大量病毒，即意味着巨额的花费花费较高。

2) 用于体内基因转导到有丝分裂后细胞类型的腺相关病毒（AAV）载体：如Spark的Luxturna是2017年获批上市的一款用于治疗RPE65基因缺陷的遗传性视网膜病变。通过AAV病毒携带正常的RPE65基因，注射入视网膜内，正常的RPE65基因并不整合到人体细胞的DNA中，而是在细胞核中合成正常的RPE65蛋白，从而触发光传导通路，恢复正常的视觉功能。

图3：目前最为常用的基因治疗病毒载体【1】

二、按基因操作的方式来讲分为两类（图4）： 

1. 基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene suppression）：通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能，不需要除异常基因；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因的表达。

2. 基因编辑（Genome editing），又分为基因纠正（gene correction）、基因敲除（gene knockout）和基因添加（gene addtion）：通过定点整合技术将外源正常的基因在特定位点进行替换或插入，将缺陷基因的异常序列进行矫正和原位特异性修复，不涉及基因组的其他任何改变。

图4：基因治疗按基因操作方式分类[1]

根据靶细胞的不同可分为体细胞和生殖细胞两类：

1. 体细胞（Somatic cell）基因治疗是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法一般是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对基因组的定点整合，目前还存在很大的困难。

2. 生殖细胞（Germ cell）基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，因此，如今更多采用的是体细胞基因治疗。

以上2种方式的最大区别是否对后代产生影响。生殖细胞基因治疗由于会将基因遗传给后代，涉及遗传和伦理学问题以及当前的技术限制，生殖细胞基因治疗法尚属禁区。如2003年颁布的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》规定，可以以研究为目的，对人体胚胎实施基因编辑和修饰，但体外培养期限自受精或者核移植开始不得超过14天。因此2018年出现的贺建奎编辑胎儿事件属于被明令禁止的，应按照中国有关法律和条例进行处理。因此在现有条件下，体细胞基因治疗成为主要的治疗方法。

基因治疗的发展历程

第一个成功的基因治疗案例是通过移植基因校正的自体造血干细胞来治疗原发性免疫缺陷病，尽管展现了良好的治疗效果，但是由于整合载体的插入突变导致的恶性转化和腺病毒载体试验中的患者死亡等不良事件的影响，导致基因治疗一度陷入低迷期[3]。

近几年来随着病毒载体的优化改造以及基因编辑技术的异军突起，基因治疗重新引来了新的曙光，主要是由于在利用体外策略（针对X连锁脊髓损伤、腺苷脱氨酶缺乏和肾上腺脑白质营养不良）和体内方法（2型Leber先天性黑蒙症和B型血友病）的临床试验中取得了突破性成功，如2018年底，Editas Medicine公司（张锋创办）宣布，其用于治疗Leber先天性黑朦10型患者（LCA10）的基因疗法（名为：EDIT-101）已经获得美国FDA批准，EDIT-101有望成为世界上第一款在人体内使用的CRISPR疗法。EDIT-101通过视网膜下注射给药，将基因编辑系统直接输送到感光细胞中而达到治疗效果，目前已获得FDA批准进入临床。

自2012年至今，西方国家已经批准了六种基因疗法：

1) 格列贝拉是一种基于AAV的家族性脂蛋白脂肪酶缺乏疗法，于2012年获得了欧洲药品管理局( EMA )的有条件营销批准。

2) IMLYGIC是一种基因修饰的1型单纯疱疹病毒，用于黑色素瘤患者不可切除病变的局部治疗，于2015年获得美国食品和药物管理局批准。

3) Strimvelis是一种基于γ-逆转录病毒的疗法，用于治疗腺苷脱氨酶缺乏引起的严重联合免疫缺陷( ADA-SCID )，于2016年获得EMA批准。

4) 2017年，美国FDA批准了三种基因疗法。KYMRIAH和YESCARTA是CD19导向的基因修饰自体CAR T细胞免疫疗法；两者都适用于非霍奇金淋巴瘤的治疗，KYMRIAH也适用于急性淋巴细胞白血病的治疗。

5) LUXTURNA是一种基于AAV的基因疗法，用于治疗双等位基因RPE65突变相关的视网膜营养不良。

下图展示了1995年-2018年期间全球注册并开发的基因治疗与临床项目的数量，可以看到自2013年注册数量快速上升，标志着基因治疗已经进入高速发展阶段。

图5：1995年-2018年期间全球注册并开发的基因治疗与临床项目的数量

基因编辑技术的突破推动基因治疗的发展

从上图看到自2013年基因疗法注册数量直线上升，这很大程度归功于基因编辑技术的突破，特别是2013年第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9系统被报道。其技术原理为：DNA双链断裂会诱导细胞的内源性修复机制，通过精确地引入DSB将有助于外源基因的高效整合。目前可精确诱导位点特异性DSB主要有四个系统：锌指核酸酶( ZFNs )、转录激活子样效应子核酸酶( TALEN )、巨核酸酶，以及最近的CRISPR/Cas9系统（图6）。

图7：四种经典的基因组编辑的DNA靶向核酸内切酶系统[4]

新一代基因编辑技术的优势

和传统基因工程中的病毒载体相比，基因编辑技术提供了一个精准的“手术剪刀”进行基因的插入，缺失以及纠正，极大地提高了基因编辑的精准性和安全性。目前，利用CRISPR/Cas9基因编辑工具已被广泛用于临床基因治疗的应用，核心的三大基因编辑公司（CRISPR Therapeutics、Editas Medicine和Intellia Therapeutics）也陆续上市，这些公司致力于基因治疗产品的研发，尽管仍处于早期的发展阶段，但为基因治疗的临床转化开辟了道路。

在过去的一年里，基因治疗，尤其在基因组编辑方面取得了一系列突破性的进展，公布了多项临床试验的相关数据，证明了基因治疗对多种人类严重疾病的有效性和安全性，美国第一批基因治疗药物也获得了FDA的批准。在政府和慈善机构的支持下，从事基础、转化和临床研究的科学家和临床医生将继续创新并开发更加高效安全的技术。生物技术和制药行业也越来越多地进军基因治疗领域，体现了这一领域的逐渐成熟，对于促进基因治疗的临床转化是必要的。然而基因治疗仍然存在许多挑战，包括解决整合基因递送载体或非靶向基因组编辑的遗传毒性，以及如何将转基因的表达或编辑效率提高到有效的治疗水平，解决体内载体重复给药的免疫反应等等。基因疗法为人类疾病提供了持久治愈的可能，以过去几年科研和临床试验的成功为例，证明继续对基因治疗保持乐观和积极的态度将有望在将来使这一疗法为患者带来福音。

参考文献：

[1] Xavier M. Anguela and Katherine A. High. 2019. Entering the Modern Era of Gene Therapy. Annual Review of Medicine. Vol. 70:273-288

[2] Cox, D. B. T. , Platt, R. J. , & Zhang, F. . (2015). Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine,21(2), 121-131.

[3] Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP, et al. 2008. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J. Clin. Investig. 118:3132–42

[4] Maeder, M. L. , & Gersbach, C. A. . (2016). Genome editing technologies for gene and cell therapy. Molecular Therapy.